近日，我中心欧阳松应教授课题组在CRISPR-Cas系统结构与功能方面取得最新进展，研究成果以题为“Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d”发表在《Nature》子刊《Nature Communications》 （(2019) 10:2544, https://doi.org/10.1038/s41467-019-10507-3）（影响因子：12.353）。我中心和福建省天然免疫生物学重点实验室为第一完成单位，欧阳松应教授为独立通讯作者。这是该课题组在《Cell Research》（2018，影响因子：15.353）期刊上发表该领域研究成果之后的又一力作^[2]。该研究解析了瘤胃球菌unculturedRuminococcus sp.Cas13d（简称UrCas13d）蛋白与CRISPR RNA（简称crRNA）二元复合物高分辨率晶体结构，揭示了UrCas13d加工precursor crRNA（简称pre-crRNA）的酶活性关键位点，UrCas13d对crRNA repeat region的核酸序列与结构的特异性识别，两个水合镁离子对于稳定crRNA repeat region的构象发挥着重要作用，鉴定了crRNA spacer region和靶RNA之间的错配耐受性等尚未研究清楚的科学问题。本研究成果为进一步改造Cas13d作为核酸编辑及检测工具，并发挥其在解决人类疾病与健康等问题上的应用潜力，提供了扎实的结构基础和理论依据。

CRISPR-Cas系统是原核生物中存在一种规律成簇的间隔短回文重复DNA序列。CRISPR-Cas系统表达的非编码RNA（CRISPR RNA，crRNA）及其相关蛋白（CRISPR associated protein, Cas）组成的复合物使得原核生物能够识别并且抵御外源核酸物质的入侵。CRISPR-Cas系统主要分为两类，它们各自又由多个类型及亚型组成。第二大类CRISPR-Cas系统中的II型CRISPR-Cas9系统和V型CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统，已经广泛并高效地应用于多种生物的基因组编辑。Cas9可以纠正个体细胞内的基因缺陷，已经从实验室研究阶段进入到临床研究阶段，具有治愈或预防多种人类疾病的潜力；然而，Cas9系统和Cas12a系统主要负责编辑DNA。针对RNA的编辑工具可以在RNA水平调节基因的功能，而不会对基因本身造成永久性改变。

图1. UrCas13d-crRNA二元复合物的结构示意图

（a）UrCas13d各结构域分布；（b）crRNA二级结构的示意图；（c）二元复合物的三维结构示意图；（d）二元复合物各结构域的表面示意图；（e）crRNA重复区域中五水合镁离子及其周围核苷酸的电子密度图；（f）五水合镁离子与其周围核苷酸、氨基酸残基之间相互作用的细节信息；（g）UrCas13d及其突变体对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果；（h）四水合镁离子及其周围氨基酸残基的电子密度图；（i）四水合镁离子与其周围氨基酸残基、核苷酸之间相互作用的细节信息；（j）二价金属离子或EDTA存在情况下，UrCas13d加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果；（k）二价金属离子或EDTA存在情况下，UrCas13d对靶RNA切割的尿素变性凝胶电泳检测结果。

2018年4月，美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Arbor生物技术公司分别报道了一种新型Cas效应蛋白，属于第二大类VI型RNA依赖的核糖核酸酶（RNase），并命名为Cas13d，该蛋白可做为一种强大RNA编辑工具用于纠正痴呆症患者细胞中引起疾病的蛋白质失衡^{[3, 4]}。与VI型其他成员类似，Cas13d具有两个HEPN（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding）结构域，自身可以加工pre-crRNA成为成熟的crRNA，结合靶RNA激活其RNase活性。虽然，Cas13d在功能上与其家族成员Cas13a-c具有一定的相似性，但是Cas13d具备一些独特之处。首先，Cas13d的蛋白序列平均长度为930个氨基酸残基，在同类蛋白中明显偏小（比其家族成员Cas13a-c小20%，比Cas9小33%），使它更容易包装到容量有限的应用载体中（比如adeno-associated virus, AAV）；其次，除了两个HEPN结构域之外，Cas13d与其他Cas13家族成员之间没有明显的序列相似性；另外，在切割靶RNA时，Cas13d的靶RNA序列两端都无须PFS（protospacer flanking sequence）；此外，含有WYL结构域的辅助蛋白可以增强Cas13d的底物酶切活性。因此，Cas13d更有潜力作为一种可操控的RNA结合模块，有效靶向细胞内的RNA转录物，为转录组工程和疾病治疗提供了一个通用平台。2018年9月，美国Salk研究所Patrick Hsu课题组和Dmitry Lyumkis课题组合作，利用低温电镜技术率先报道了惰性真杆菌Eubacterium siraeumCas13d（EsCas13d）不同功能状态下的复合物冷冻电镜结构^[5]。

图2. crRNA repeat region结构与序列的特异性识别

（a）crRNA repeat region结合在UrCas13d的NTD，HEPN-1和HEPN-2结构域形成的孔道中，其核苷酸U（-24）-A（-13）暴露在蛋白表面外；（b）UrCas13加工pre-crRNA或其△-stem突变体（pre-crRNA缺失了核苷酸U（-24）-A（-21）/U（-16）-A（-13））的尿素变性凝胶电泳检测结果；（c）UrCas13d与crRNA或其△-stem突变体(crRNA缺失了核苷酸U（-24）-A（-21）/U（-16）-A（-13））形成的复合物切割靶RNA的尿素变性凝胶电泳检测结果；（d）UrCas13d加工pre-crRNA或其突变体的尿素变性凝胶电泳检测结果；（e）UrCas13d与crRNA或其突变体形成的复合物切割靶RNA的尿素变性凝胶电泳检测结果。

本研究中，欧阳松应教授课题组解析了UrCas13d蛋白和crRNA二元复合物1.86Å高分辨率的晶体结构，并开展了相应的功能实验^[1]。发现在UrCas13d-crRNA二元复合物中，成熟的crRNA结合在UrCas13d的紧凑双叶型结构所形成的通道内，两个水合镁离子对于稳定crRNA repeat region的构象发挥着重要作用；其中一个五水合镁离子通过多个氢键稳定crRNA repeat region的构象，将与该水合镁离子直接相互作用的氨基酸残基突变，发现靶RNA切割活性显著降低。进一步的实验表明，二价金属离子对于pre-crRNA加工不是必需的，但对于Cas13d的靶RNA切割是至关重要的；与Cas13家族其他成员的研究结果相比所不同的是，UrCas13d蛋白加工pre-crRNA的酶活性中心位于HEPN-2结构域上，其氨基酸残基R802和K905对于pre-crRNA切割是极其重要的；crRNA repeat region的核苷酸U（-8）-C（-1）的序列和结构被UrCas13d特异性识别，该区域的核酸序列和三维结构对于靶RNA的切割是必需的；在二元复合物中，crRNA repeat region的核苷酸U（-24）-A（-13）暴露于环境溶剂中，删除该区域内四个Watson-Crick碱基对（base pair）既不改变UrCas13d的pre-crRNA加工能力也不改变其靶RNA切割能力；针对UrCas13d两个HEPN结构域上靶RNA切割关键位点R288A或H828A，突变体蛋白足以破坏蛋白对靶RNA切割活性。此外，通过crRNA spacer region和靶RNA之间的错配耐受性实验，研究发现spacer region的两个子区域（an internal and a 3-end region）与靶RNA之间的正确碱基配对对于靶RNA切割是必需的。

图3. UrCas13d参与pre-crRNA加工及靶RNA切割的酶活性位点

（a）参与pre-crRNA加工的UrCas13d酶活性位点示意图；（b）野生型UrCas13d及可能参与pre-crRNA加工的UrCas13d突变体加工pre-crRNA的尿素变性凝胶电泳检测结果；（c）切割靶RNA的UrCas13d酶活性位点示意图；（d）crRNA与靶RNA之间错配耐受性的示意图;（e）crRNA与靶RNA错配耐受性的尿素变性凝胶电泳检测结果。

张博博士和研究生叶阳苗为本文的共同第一作者，该研究得到国家自然科学基金和福建师范大学的经费资助，上海同步辐射光源（SSRF）BL-17U1对该研究提供了重要的技术支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-10507-3

[1]. Zhang, B. et al. Two HEPN domains dictate CRISPR RNA maturation and target cleavage in Cas13d. Nature Communications. 10:2544(2019).DOI：10.1038/s41467-019-10507-3.

[2]. Zhang, B. et al. Structural insights into Cas13b-guided CRISPR RNA maturation and recognition. Cell Res 28, 1198–1201 (2018).

[3]. Konermann, S. et al. Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors. Cell 173, 665-676 e14 (2018).

[4]. Yan, W.X. et al. Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein. Mol Cell 70, 327-339 e5 (2018).

[5]. Zhang, C. et al. Structural Basis for the RNA-Guided Ribonuclease Activity of CRISPR-Cas13d. Cell 175, 212-223 e17 (2018).